식품공전 미생물 클로스트리디움 보툴리눔 실험방법

클로스트리디움 보툴리눔은 열에 강한 균이며 포자가 독소를 생성할 수 있어 주의해야 하는 균으로 검출할 수 있는 시험방법에 대해 알아보겠습니다.

출처 : Pixabay

클로스트리디움 보툴리눔이란?

클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)은 그람 양성의 자균성 세균으로 동물의 근육, 수축 또는 마비시키는 균으로 우리가 흔히 아는 보톡스 균으로도 알려져 있습니다. 혐기성 세균으로 통조림처럼 캔 형태의 혐기성 상태인 제품에서 주로 발견되며 120℃에서 20분간 제대로 가열처리 되지 않았거나 보관, 운송 중에 흠집이 생기는 경우 발생할 수 있는 균입니다. 열에 강한 포자를 만들기 때문에 살균 처리를 한다고 해도 균은 죽지만 포자는 생존할 수 있어 이럴 경우 독소를 생성해 식중독에 걸릴 수 있습니다.

클로스트리디움 보툴리눔 실험 배지

(배지 33) Cooked Meat 배지(Cooked Meat Medium) 배지 조성
Beef Heart - 454 g / Proteose Peptone - 20 g / Dextrose - 2 g / Sodium Chloride - 5 g

 

(배지 50) TPGY 배지(Trpticase Peptone Glucose Yeast Extract Broth)
Trypticase - 50 g / Peptone - 5 g / Yeast Extract - 20 g / Dextrose - 4 g / Sodium Thioglycollate - 1 g

 

(배지 51) Liver-Veal 난황한천배지(Liver-Veal Egg Yolk Agar)
Liver Infusion - 50.0 g / Veal Infusion - 500.0 g / Proteose Peptone - 20.0 g / Neopeptone - 1.3 g / Tryptone - 1.3 g / Dextrose - 5 g / Soluble Starch - 10 g / Isoelectric Casein - 2 g / Sodium Chloride - 5 g / Sodium Nitrate - 2 g / Gelatin - 20 g / Agar - 15 g

클로스트리디움 보툴리눔 실험 방법(증균배양)

※ 액상 검체는 그대로 사용하며 고체, 반 고형물 등의 검체는 동량의 젤라틴 인산완충용액(시약 5)를 첨가하고 균질화한 후 실험 용액으로 사용합니다.
※ 시험용액을 접종하기 전 각 배지는 탈산소를 위해 10~15분간 중탕 후 빠르게 냉각 후 사용합니다.
※ 검체는 롱피펫팁을 이용해 배지 아랫부분에 천천히 접종하고 교반하지 않습니다.
1. Cooked meat 배지 15ml에 각각 검체 1~2g 또는 1~2ml를 접종 후 35~37℃, 7일간 배양하고 TPGY배지 15ml도 Cooked meat 배지와 동일하게 실험 용액 접종 후 26℃, 7일간 배양합니다.
2. 클로스트리디움이 관찰되면 분리배양을 진행하고 미관찰 되는 경우 10일간 추가 배양합니다.

클로스트리디움 보툴리눔 실험 방법(분리배양)

증균 배양 후 클로스트리디움이 관찰된 Cooked meat배지와 TPGY배지의 증균배양액 1~2ml를 동량의 여과 제균한 알코올과 섞어 실온에서 1시간 동안 방치한 후, Liver-Veal 난황한천배지(배지 51) 또는 혐기성 난황한천배지(배지 52)에 접종 후 혐기환경에서 35~37℃에서 48±3시간 동안 배양합니다. 배양 후 집락 주위에 혼탁한 환이 생기거나 표면이 거칠거나 매끈하고 퍼져있거나 불규칙한 집락을 선택해 확인시험을 진행합니다.
※ 난황액과 반응하는 경우 혼탁한 환이 생길 수 있습니다.

클로스트리디움 보툴리눔 실험 방법(확인시험)

분리배양에서 분리한 집락에 대해 그람 양성의 간균, 균체 말단에 아포가 형성되는 것을 관찰합니다. 호기 조건에서 35~37℃, 2~3일간 배양할 경우 균이 미발육으로 확인되어야 하며 GAM 배지 0.1% glucose 첨가에 접종 후 운동성이 있는 경우 양성으로 판정합니다. 질산염환원능이 없는지 GAM 배지, 지시약을 사용해 색의 변화가 없는지 확인하고 우유를 분해하는 것을 양성으로 판정합니다. 자세한 내용은 식품공전에 나와 있는 실험법 또는 생화학 실험을 통해 클로스트리디움 보툴리눔이 맞는지 확인시험을 진행해 판정합니다.